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        elisa檢測方法有哪些?
        發布時間:2022-09-05   點擊次數:92次
          elisa檢測是酶聯免疫吸附測定的英文簡稱,是利用抗原抗體結合專一性,進行免疫反應的定性和定量測量方法。通過免疫吸附劑、結合物、酶反應的底物可設計出各種不同類型的檢測方法。elisa檢測的方法主要有雙抗原夾心法測抗原、雙抗體夾心法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、間接法測抗體、捕獲包被測法測抗體等多種類型。其中間接法測抗體主要用于對病原體抗體的檢測,進行傳染病的診斷。
          ELISA通常分為四種類型:直接法、間接法、競爭法、夾心法等。
          直接法(Direct ELISA)僅需要抗原和酶標一抗,操作簡便,可避免交叉反應,然而該方法要求酶標一抗有較高的特異性要求,同時也并非所有的一抗適合標記處理。直接法在實際運用中并不多見,它并不能對樣本中抗體進行定量分析,因為樣本中抗體是非酶標抗體,無法進行后續顯色,但是該法經過改進就是競爭性ELISA方法,見后文。
          間接法(Indirect ELISA)使用了二抗增加信號強度,也使抗體的選擇多樣化,然而間接法容易產生交叉反應。間接法只能用于測定抗體,主要用于疾病的診斷,其優點是只需要改變包被抗原,酶標抗體是通用的。
          夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法:
          雙抗體夾心法中抗原被兩個抗體——捕捉抗體和檢測抗體,結合于不同位點。捕捉抗體固定于載體上,檢測抗體通過結合抗原進行顯色分析。應用于雙抗體夾心法檢測的抗體需是單抗,而且對同一抗原結合位點不同,如此才能避免交叉反應或兩種抗體競爭性結合同一位點。夾心法具有高靈敏度、高專一性的優勢,但該法只適用于有多個結合位點的抗原檢測,主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫學檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于雙抗體夾心法特異性高,在檢測過程中有時會將樣本和酶標抗體同時加入進行反應(一步法),此時如果樣本中抗原含量過高會導致其與固相抗體和酶標抗體均有結合而不形成“夾心復合物”,此時測出的結果將低于實際含量甚至是陰性結果(鉤狀效應hook ffect)。因此,如果使用一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍,另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應。
          雙抗原夾心法中抗原被包被于固相,檢測樣本中的抗體結合于抗原后,使用酶標的抗原進行結合及后續反應,可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關鍵在于酶標抗原的制備,需要根據抗原結構進行設計,在醫學檢驗上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法,檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定,故此靈敏度相對而言高于間接法。
          競爭法(Competitive ELISA)是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標抗體/抗原競爭性結合的分析方法。當游離抗體(或抗原)濃度越高,則能與固定抗原(或抗體)結合的酶標抗體(或抗原)就越少,后續顯色就越淺,即與對照相比,顯色越淺,表示檢測樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法適合比較不純的樣本,且重復性好,但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗體常常用于檢測某些干擾物質不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原,這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點,不適用于雙抗夾心法進行測定。
          捕獲包被法也稱為反向間接法,主要用于測定血清中某類抗體亞型如IgM。為排除血清中IgG的干擾,用抗IgM抗體包被后用于捕捉樣本中的IgM,然后加入特異性結合抗原進行后續檢測。捕獲包被法常用于對病毒性感染的早期診斷。在測定IgM的實驗中常受到類風濕因子(RF,一種能結合多種動物IgG Fc的自身IgM抗體)的干擾,導致假陽性反應。采用F(ab')或Fab片段制備酶標抗體可以消除RF的干擾,這一方法在雙抗體夾心法中也具有同樣的效用。
          除了這五種檢測方法,新興的ELISA檢測技術不斷被開發出來,例如基于細胞的ELISA(cell-based ELISA),是將細胞接種于微孔板中取代原來的抗原,該方法可以對一些處理造成的實時動態的蛋白含量變化進行測定,無需裂解細胞,可減少目的蛋白的損失,而其缺點即不能對抗原進行定量分析。
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